動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中嗅覺(jué)評(píng)估方法概述
【摘要】 嗅覺(jué)功能目前正受到越來(lái)越多的關(guān)注，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的嗅覺(jué)評(píng)估方法很多，但是目前為止還沒(méi)有一個(gè)**、客觀、高特異性的金標(biāo)準(zhǔn)方法出現(xiàn)，本文就目前動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的常見的嗅覺(jué)評(píng)估方法(包括行為學(xué)、影像學(xué)、電生理學(xué)、組織形態(tài)學(xué)等多種類型的實(shí)驗(yàn)方法)進(jìn)行一個(gè)概括性的介紹并簡(jiǎn)單分析其優(yōu)缺點(diǎn)。
【關(guān)鍵詞】 嗅覺(jué); 嗅覺(jué)障礙; 評(píng)估方法; 動(dòng)物實(shí)驗(yàn); 文獻(xiàn)綜述
嗅覺(jué)是人體原始的感覺(jué)功能之一，它同視覺(jué)、聽覺(jué)一樣，是人體捕獲外界信息的特殊裝置。嗅覺(jué)還可以通過(guò)**神經(jīng)系統(tǒng)影響人的情緒、調(diào)節(jié)生命周期。嗅覺(jué)障礙患者對(duì)周圍的事物不感興趣，反應(yīng)平淡，生活質(zhì)量下降，更可以造成精神上的壓抑或憂郁。王鴻等[1]報(bào)道用T&T測(cè)試法測(cè)試了1 035例慢性鼻竇炎鼻息肉患者，86.3%的患者有嗅覺(jué)功能障礙，與患者的主訴有極顯著的差異，說(shuō)明嗅覺(jué)功能改變沒(méi)有受到患者的注意。近幾年隨著人們對(duì)生活質(zhì)量要求的提高，對(duì)嗅覺(jué)障礙的關(guān)注程度有了很大的提高。
嗅覺(jué)評(píng)估不僅僅是要判斷嗅覺(jué)功能是否正常，還需要進(jìn)一步判斷嗅覺(jué)障礙的程度、性質(zhì)、部位等因素，如果能提示病因以及預(yù)后則更有臨床、實(shí)驗(yàn)應(yīng)用的價(jià)值。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中關(guān)于嗅覺(jué)功能的研究已經(jīng)有了較長(zhǎng)的歷史，出現(xiàn)了多種實(shí)驗(yàn)方法，但是目前為止還沒(méi)有一個(gè)**、客觀、高特異性的金標(biāo)準(zhǔn)方法出現(xiàn)，本文就目前動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的常見的嗅覺(jué)評(píng)估方法進(jìn)行一個(gè)概括性的介紹。
1 行為學(xué)方法
動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)的*大區(qū)別在于動(dòng)物無(wú)法準(zhǔn)確地和實(shí)驗(yàn)者交流，所以行為學(xué)方法在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中就顯得極為重要。嗅敏動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶能力、尋食能力等與嗅覺(jué)有很高的相關(guān)性，可以觀察、記錄其行為學(xué)的改變，從而判斷其嗅覺(jué)功能的變化。目前報(bào)道較多的可以評(píng)估嗅覺(jué)功能的行為學(xué)方法有以下幾種。
1.1 埋藏食物小球?qū)嶒?yàn)(buried food pellet test，BFPT)
BFPT是目前*常用于檢測(cè)動(dòng)物嗅覺(jué)功能的行為學(xué)檢測(cè)方法[2]。目前比較通用的方法由Nathan等[3]于2004年報(bào)道，他的實(shí)驗(yàn)中使用找尋食物小球等待時(shí)間作為數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，即從小鼠被隨機(jī)放置于盒子中開始，到小鼠揭開食物小球并用它的前爪或牙齒抓住食物小球的時(shí)間，如果5 min(300 s)內(nèi)小鼠未找到食物小球，即被移走。林靜等[4]以300 s(5次測(cè)試的平均值)內(nèi)未找到食物小球作為判定小鼠存在嗅覺(jué)功能障礙的標(biāo)準(zhǔn)，并認(rèn)為以300 s作為分組標(biāo)準(zhǔn)是合理的。
1.2 嗅覺(jué)測(cè)量?jī)x
Slotnick等[5]利用行為學(xué)原理設(shè)計(jì)出一種用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的嗅覺(jué)測(cè)量?jī)x，可以通過(guò)改變氣味的濃度后觀察動(dòng)物的行為學(xué)變化來(lái)評(píng)價(jià)其嗅覺(jué)。該系統(tǒng)經(jīng)眾多實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其對(duì)動(dòng)物嗅覺(jué)的檢測(cè)是有效的，因操作方便且可進(jìn)行多種設(shè)計(jì)，此方法被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物嗅覺(jué)功能的評(píng)估。
1.3 雙瓶實(shí)驗(yàn)
有研究證實(shí)小鼠、大鼠在分辨某些物質(zhì)的時(shí)候主要是依賴于嗅覺(jué)而非味覺(jué)，例如鹽酸、鹽酸奎寧(quinine HCl, QHCl)等有一定揮發(fā)性的物質(zhì) [7]。因嗅覺(jué)障礙時(shí)動(dòng)物分辨飲用水和實(shí)驗(yàn)溶液的能力下降，通過(guò)兩種溶液被動(dòng)物飲用的程度可以評(píng)估動(dòng)物嗅覺(jué)障礙的程度。
1.4 幼鼠超聲發(fā)聲實(shí)驗(yàn)
新生小鼠嗅覺(jué)的產(chǎn)生比其他的感覺(jué)要早。新生小鼠嗅到成年鼠窩的氣味時(shí)可發(fā)出一種超聲作為回應(yīng)，檢測(cè)這種超聲的出現(xiàn)與否可以判斷其嗅覺(jué)功能是否正常[8]。Lemasson等[8]用3甲基吲哚來(lái)破壞新生小鼠的嗅上皮，結(jié)果成功地證實(shí)了該檢測(cè)方法的可行性。而且在該實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)由于被破壞嗅覺(jué)的小鼠無(wú)法正確識(shí)別**，其生存率大大降低，證明了嗅覺(jué)對(duì)新生小鼠有極其重要的作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中嗅覺(jué)評(píng)估方法概述
行為學(xué)方法在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的嗅覺(jué)評(píng)估中有很重要的作用，歷史悠久、技術(shù)成熟，實(shí)驗(yàn)方法較為簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)裝置花費(fèi)較少，對(duì)嗅覺(jué)功能的初步評(píng)估價(jià)值較為肯定(尤其是埋藏食物小球?qū)嶒?yàn)和Slotnick的嗅覺(jué)測(cè)量?jī)x)，可行性及可重復(fù)性較高。需要注意的是本類實(shí)驗(yàn)受個(gè)體差異影響較大，實(shí)驗(yàn)前應(yīng)經(jīng)預(yù)評(píng)估剔除先天差異比較大的個(gè)體，而且樣本量不宜過(guò)小，有時(shí)候還需對(duì)動(dòng)物進(jìn)行預(yù)先的訓(xùn)練。為保證實(shí)驗(yàn)的客觀性，需要很好地進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與控制，有時(shí)連晝夜節(jié)律等變化的影響都需要考慮在內(nèi)。行為學(xué)測(cè)試結(jié)果對(duì)嗅覺(jué)功能評(píng)估只是一個(gè)綜合的結(jié)果，對(duì)嗅覺(jué)障礙程度、部位等的判斷較差，如果能結(jié)合嗅覺(jué)誘發(fā)電位等客觀檢查可以做到更加客觀、可信。在過(guò)去的實(shí)驗(yàn)中行為學(xué)測(cè)試往往與組織學(xué)檢查相結(jié)合，既增加了實(shí)驗(yàn)的客觀性，又為進(jìn)一步研究嗅覺(jué)產(chǎn)生機(jī)制或嗅覺(jué)障礙的原因提供了基礎(chǔ)。
2 客觀評(píng)估方法
嗅覺(jué)的感受、傳導(dǎo)是個(gè)比較復(fù)雜的過(guò)程，氣味分子通過(guò)鼻腔到達(dá)嗅黏膜后被其表面的黏液所吸附，進(jìn)而在黏膜層中擴(kuò)散，到達(dá)嗅細(xì)胞。達(dá)到閾濃度的氣味分子可刺激嗅細(xì)胞產(chǎn)生嗅覺(jué)電位，這是其感受過(guò)程。產(chǎn)生的嗅覺(jué)電位通過(guò)嗅神經(jīng)穿過(guò)篩骨篩板，到達(dá)嗅球，其內(nèi)有第2級(jí)神經(jīng)元，再通過(guò)嗅束傳導(dǎo)至初級(jí)嗅皮質(zhì)及皮質(zhì)內(nèi)側(cè)核，而后至海馬回的內(nèi)嗅皮層即次級(jí)嗅皮層，神經(jīng)沖動(dòng)引起大腦皮層的激活才能*后引發(fā)嗅覺(jué)。嗅覺(jué)功能的客觀評(píng)估方法包括了對(duì)嗅覺(jué)感受、傳導(dǎo)通路上各種指標(biāo)，例如影像學(xué)、電生理學(xué)、組織學(xué)等的測(cè)量。目前動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中使用較多的及可能有較大發(fā)展前景的客觀評(píng)估方法包括以下幾類。
2.1 組織學(xué)方法
這里的組織學(xué)是泛指解剖取組織后進(jìn)行的所有檢查，包括大體解剖學(xué)、病理學(xué)、**學(xué)、分子生物學(xué)等諸多學(xué)科的檢查方法。嗅覺(jué)系統(tǒng)的改變既可以由病變本身引起也可以是因?yàn)樾嵊X(jué)障礙后的退行性變引起。組織檢查比結(jié)構(gòu)影像檢查更有評(píng)估價(jià)值，因其可以更好地提示病因，也利于更好地研究嗅覺(jué)通路和嗅覺(jué)障礙產(chǎn)生的機(jī)制。目前組織學(xué)方法在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中有很廣泛的應(yīng)用，從部位選擇上看整個(gè)嗅覺(jué)傳導(dǎo)通路包括從嗅黏膜直到海馬回的內(nèi)嗅皮層都有報(bào)道，從實(shí)驗(yàn)方法上看更是復(fù)雜多樣，*常用的幾種方法有如下幾種。
2.1.1 病理學(xué)檢查 這是早期**學(xué)技術(shù)及分子生物學(xué)技術(shù)還不是很發(fā)達(dá)時(shí)常用的檢查手段，在早期嗅覺(jué)研究中有較多的應(yīng)用，在嗅覺(jué)障礙的動(dòng)物標(biāo)本上可以看到細(xì)胞凋亡、空泡等變化，雖然特異性較差，但是也能提供宏觀的信息，現(xiàn)在常常和其他檢查方法一起使用，例如在陳志宏等的實(shí)驗(yàn)中在進(jìn)行其他檢查之前使用了HE染色方法檢查了模型小鼠的嗅上皮，發(fā)現(xiàn)其嗅上皮變薄，其中的感覺(jué)神經(jīng)元的細(xì)胞核層數(shù)變少[9]。
2.1.2 蛋白及核酸表達(dá)的檢查 對(duì)相應(yīng)組織中某些標(biāo)志性蛋白及核酸的檢查可以間接地反映嗅覺(jué)功能及提示嗅覺(jué)障礙的原因。例如用**組化方法檢查嗅覺(jué)通路中嗅標(biāo)記蛋白(olfactory marker protein, OMP)、酪氨酸羥(tyrosine hybroxylas, TH)、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)、cFos蛋白等標(biāo)記物在許多文獻(xiàn)中都有記載。Buron等[10]在丙酮吸入誘導(dǎo)的嗅覺(jué)障礙實(shí)驗(yàn)中使用了嗅上皮組織的OMP及增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)作為觀察指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)丙酮對(duì)于嗅上皮的損傷是有選擇性的。有學(xué)者使用多巴胺及細(xì)小白蛋白作為標(biāo)記物進(jìn)行**組化檢查，發(fā)現(xiàn)失嗅動(dòng)物模型的嗅球中含多巴胺及細(xì)小白蛋白的神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量明顯減少，認(rèn)為通過(guò)該失嗅動(dòng)物模型可以對(duì)嗅球萎縮進(jìn)行定量描述，提示多巴胺及細(xì)小白蛋白在嗅球中的表達(dá)對(duì)于失嗅的作用[11]。cFos蛋白可反映大腦組織活動(dòng)程度，對(duì)cFos蛋白的觀察可以一定程度上起到功能磁共振的作用[12]。
2.2 電生理學(xué)方法
2.2.1 嗅電圖 將電極直接置于嗅區(qū)黏膜，當(dāng)其接受嗅素刺激時(shí)記錄到的一種慢相負(fù)性電位變化稱為嗅電圖，目前普遍認(rèn)為它是單個(gè)嗅細(xì)胞電位變化的總和，嗅電圖已經(jīng)在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)[13]。嗅電圖*大的缺陷在于雖然其對(duì)嗅黏膜損傷引起的嗅覺(jué)障礙有較大的意義，但是對(duì)于黏膜后傳導(dǎo)通路以及嗅球、海馬回等**病變導(dǎo)致的嗅覺(jué)障礙沒(méi)有什么評(píng)估價(jià)值。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中嗅覺(jué)評(píng)估方法概述
2.2.2 嗅覺(jué)腦電圖 嗅覺(jué)誘發(fā)腦電圖是指在給予嗅刺激時(shí)，實(shí)驗(yàn)對(duì)象的腦電圖可發(fā)生變化，Hirano等[14]用狗做實(shí)驗(yàn)時(shí)成功地獲得了該變化，在他的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)腦電圖的快波對(duì)嗅覺(jué)功能的意義較大。嗅覺(jué)誘發(fā)腦電圖又相繼在大鼠等其他動(dòng)物身上得到了驗(yàn)證[15]。嗅覺(jué)腦電圖產(chǎn)生的機(jī)制還不是很明確，而且其特異性不是很高，故目前在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中研究、應(yīng)用的較少。
2.2.3 嗅覺(jué)誘發(fā)電位 又稱為嗅覺(jué)事件相關(guān)電位(olfactory eventrelated potentials,OERP)，*早是用電刺激動(dòng)物嗅黏膜時(shí)在頭皮特定部位記錄到穩(wěn)定的腦電位的變化，該方法經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的發(fā)展后認(rèn)為其和自然嗅覺(jué)之間有一定的差距，故逐漸被化學(xué)氣味誘導(dǎo)的嗅覺(jué)誘發(fā)電位所取代，目前使用的已經(jīng)比較少。早期化學(xué)氣味刺激除了有嗅覺(jué)刺激外還常常伴有物理刺激及對(duì)三叉神經(jīng)的化學(xué)刺激，這些非嗅刺激干擾了正常嗅覺(jué)誘發(fā)電位的獲得。隨著僅能興奮嗅覺(jué)系統(tǒng)而不興奮三叉神經(jīng)系統(tǒng)的化學(xué)物質(zhì)如香草醛等，以及Kobal式嗅覺(jué)刺激器的出現(xiàn)，嗅覺(jué)誘發(fā)電位研究成為嗅覺(jué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。嗅覺(jué)誘發(fā)電位儀至少包括嗅覺(jué)刺激器及腦電采集系統(tǒng)，測(cè)量時(shí)需要在電聲屏蔽室進(jìn)行，且需要給予一定的白噪聲掩蔽刺激探頭釋放刺激時(shí)產(chǎn)生的干擾噪聲。目前動(dòng)物嗅覺(jué)誘發(fā)電位各波的具體來(lái)源以及與**間的相互關(guān)系還不清楚，嗅覺(jué)誘發(fā)電位的出現(xiàn)是否意味著動(dòng)物確實(shí)產(chǎn)生了嗅覺(jué)還不能肯定，所以用來(lái)證明嗅覺(jué)傳導(dǎo)通路是否暢通比較可行[16]，而暫不能用于嗅性**的定位、定性診斷。嗅覺(jué)誘發(fā)電位應(yīng)該是*可能成為動(dòng)物嗅覺(jué)評(píng)估客觀標(biāo)準(zhǔn)的檢查方法。
3 影像學(xué)方法
3.1 嗅覺(jué)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)影像檢查
有研究證明嗅球及嗅束等神經(jīng)結(jié)構(gòu)的生長(zhǎng)與周圍神經(jīng)沖動(dòng)的輸入有關(guān)[17]，所以嗅覺(jué)障礙后嗅覺(jué)系統(tǒng)各部位可有一定的不依賴于年齡的結(jié)構(gòu)改變，通過(guò)磁共振影像檢查可以發(fā)現(xiàn)這些改變，例如嗅球體積變小、嗅溝缺失或變淺、嗅束缺失等現(xiàn)象，從而間接評(píng)價(jià)嗅覺(jué)功能。
3.2 嗅覺(jué)系統(tǒng)功能影像檢查
這是目前嗅覺(jué)研究的熱點(diǎn)方向之一，主要技術(shù)有功能性磁共振成像(fMRI)、PET成像和腦信號(hào)的光學(xué)成像等。
3.2.1 功能磁共振檢查 功能磁共振檢查技術(shù)有很多，用于嗅覺(jué)系統(tǒng)功能的fMRI技術(shù)主要是(blood level dependent fMRI, BOLD fMRI)，當(dāng)氧合血紅蛋白的比例增加時(shí)或去氧血紅蛋白含量減少時(shí)，T2信號(hào)縮短效應(yīng)減弱，表現(xiàn)為MR信號(hào)增強(qiáng)。嗅覺(jué)功能成像既能反映血流的變化，也能反映神經(jīng)元活動(dòng)的代謝變化，近些年在研究神經(jīng)功能方面發(fā)揮著巨大的作用，特別是fMRI無(wú)放射暴露，可反復(fù)測(cè)試，且時(shí)間、空間分辨率要優(yōu)于PET成像，故是目前嗅覺(jué)功能成像的主要方法。在大鼠實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)證實(shí)，7 T的fMRI能夠顯示氣味刺激后大鼠嗅球的活化[11]。其空間分辨率很高，對(duì)于研究嗅覺(jué)相關(guān)皮層的定位、嗅覺(jué)功能障礙情況下嗅覺(jué)相關(guān)皮層反應(yīng)的變化等有極大的應(yīng)用價(jià)值。有學(xué)者擬通過(guò)信息技術(shù)將嚙齒類動(dòng)物嗅球的激活圖像編成二維的氣味圖(OdorMap，OM)及氣味圖數(shù)據(jù)庫(kù)(OdorMap Database，OMDB)以利于嗅覺(jué)工作者對(duì)嗅覺(jué)系統(tǒng)的研究[18]。功能磁共振應(yīng)用在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的嗅覺(jué)評(píng)估中需要注意的是：首先動(dòng)物是不能配合磁共振檢查的，故需要在麻醉下進(jìn)行;其次磁共振是強(qiáng)磁場(chǎng)環(huán)境，故嗅覺(jué)刺激裝置不能由金屬制成。
3.2.2 腦功能光學(xué)成像 腦功能光學(xué)成像是近年來(lái)神經(jīng)外科的熱點(diǎn)研究方向，目前主要的實(shí)驗(yàn)技術(shù)有激光散斑襯比成像和內(nèi)源信號(hào)光學(xué)成像。而應(yīng)用于嗅覺(jué)功能檢查的主要是內(nèi)源信號(hào)光學(xué)成像，這里所指的內(nèi)源信號(hào)，并不是神經(jīng)元所表現(xiàn)出來(lái)的電信號(hào)，而是指由神經(jīng)元活動(dòng)所引起的有關(guān)物質(zhì)組分、運(yùn)動(dòng)狀態(tài)的改變而導(dǎo)致其光學(xué)特性的變化，在與某些特定波長(zhǎng)的光量子相互作用后，得到的包含了這些特性的光信號(hào)，包括：血紅蛋白信號(hào)、氧合血紅蛋白信號(hào)、光散射特征信號(hào)等[1920]。許多生理性過(guò)程如血紅蛋白氧合度、細(xì)胞色素的氧合狀態(tài)、神經(jīng)膠質(zhì)和神經(jīng)元腫脹、功能性血流量改變等變化，都會(huì)影響到組織光反射特性的改變。通過(guò)探測(cè)反射光的變化量，就可以獲得這種特異性的內(nèi)源光學(xué)信號(hào)。內(nèi)源光學(xué)信號(hào)成像在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中已用于多種腦功能皮層功能的檢查，比如視覺(jué)(貓、小鼠等)、軀體感覺(jué)皮層(大鼠、貓、松鼠猴等)、聽覺(jué)皮層(南美栗鼠、貓、雪貂等)。Bathellier等[21]在實(shí)驗(yàn)中使用了內(nèi)源光學(xué)信號(hào)原理和突觸素?zé)晒鈽?biāo)記兩種方法分別獲得了香芹酮、苯甲酸甲酯刺激后大鼠嗅球的激活情況，在內(nèi)源光學(xué)信號(hào)成像下，激活的嗅小球反光率下降，呈相對(duì)的冷色調(diào)，而在熒光標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中激活區(qū)域熒光反應(yīng)較強(qiáng)。雖然內(nèi)源光學(xué)信號(hào)成像的時(shí)空分辨率都較高，但是其穿透腦皮層的能力受限(大約數(shù)百微米)，所以對(duì)于深層腦組織的觀察就沒(méi)有什么效果了。由于內(nèi)源光學(xué)信號(hào)的確切生理來(lái)源至今沒(méi)有定論，所以為了闡述內(nèi)源光信號(hào)對(duì)應(yīng)的生理意義及其與神經(jīng)元電活動(dòng)的關(guān)系，還需要與其他方法進(jìn)行對(duì)比研究。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中嗅覺(jué)評(píng)估方法概述
從其他感覺(jué)的評(píng)估方法來(lái)看，功能磁共振和誘發(fā)電位是研究的發(fā)展方向，但目前嗅覺(jué)產(chǎn)生、傳導(dǎo)機(jī)制尚未完全明了，相關(guān)檢查技術(shù)尚處于起步階段，還需要進(jìn)行大量的研究。目前的嗅覺(jué)研究可以根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)要求及實(shí)驗(yàn)條件選擇不同的實(shí)驗(yàn)方法及實(shí)驗(yàn)方法的組合。嗅覺(jué)誘發(fā)電位及功能磁共振檢查由于其初期投入較大，對(duì)硬件及技術(shù)條件要求較高，開展難度較大，在國(guó)內(nèi)只有少數(shù)醫(yī)院在從事這方面的實(shí)驗(yàn)。行為學(xué)方法操作簡(jiǎn)單，技術(shù)成熟，效果肯定，有很強(qiáng)的實(shí)用價(jià)值。組織學(xué)方法對(duì)于機(jī)理的研究十分重要，并且隨著對(duì)嗅覺(jué)認(rèn)知的加深，越來(lái)越多的標(biāo)記物被發(fā)現(xiàn)，評(píng)估方法也越來(lái)越豐富。如果可以出現(xiàn)一種簡(jiǎn)單易行的嗅覺(jué)評(píng)估方法，那么可以極大地促進(jìn)嗅覺(jué)的研究。
