【上海欣軟整理】捕食應激致大鼠的持續(xù)性情緒喚醒障礙

摘要

目的：探討嚴重心理應激是否可引發(fā)實驗大鼠較長時間的情緒喚醒水平障礙，以建立較理想的創(chuàng)傷后應激障礙動物模型。

方法：實驗于2004- 01 /2005- 06 在解放軍成都**成都總醫(yī)院完成。選擇雄性Wistar 大鼠135只, 成組設計隨機分為捕食應激組75 只和正常對照組60 只。先將大鼠放入捕食應激實驗箱的小籠中，再將一只饑餓的貓放入實驗箱中，使貓與大鼠無生理傷害性接觸，致大鼠出現(xiàn)輕微驚恐性顫動及因驚嚇所致呼吸急促而快速鼻翼煽動6～8 min；正常對照組大鼠除不接觸貓外，其他處理程序相同。并通過大鼠運動活性、探究行為、拒俘反應性和高架十字迷宮實驗觀測應激后4個月內實驗大鼠情緒喚醒水平改變，同時以Morris 水迷宮法檢測其空間學習和記憶能力。采用SPSS 9.0 軟件進行單因素或雙因素方差分析，以及各組均數(shù)的SN-K法和Tamhane’s T2 法檢驗。

結果：參與實驗大鼠135只在實驗過程中無死亡，均進入結果分析。①與正常對照組相比，捕食應激后1個月內應激大鼠曠場爬越行為明顯減少[（71.5±13.5），（96.8±18.4）分，P < 0.05]；4 個月時后肢性站立仍明顯減少[（11.4±2.1），（17.9±3.3）分，P < 0.05]。②與正常對照組相比，高架十字迷宮實驗中應激大鼠進入開臂次數(shù)百分比和開臂滯留時間百分比均明顯降低[(4.8±0.9)%，(20.7±3.7)%，P < 0.01]；[(0.9±0.2)%，(6.6±1.2)%，P < 0.01]。③與正常對照組相比，拒俘反應性則在應激后2 個月內明顯增加[（2.4±0.5），（1.5±0.4）分，P < 0.05]。④與正常對照組相比，捕食應激后第1 天應激大鼠在Morris 水迷宮空間覓向訓練中潛伏期明顯延長訓練15 次時為(32±6)，(17±3) s，P < 0.05]，在空間定向能力測試時應激大鼠水迷宮的4個象限中無目的漫游所花費時間百分比差異無顯著性意義。應激后2 周時大鼠空間學習和記憶能力測試無明顯改變。

結論:單純捕食應激成功誘發(fā)了實驗大鼠持續(xù)性運動活性減少、探究行為受抑、警覺水平過高、焦慮不安狀態(tài)、環(huán)境適應能力下降、驚恐逃避反應等多種情緒喚醒障礙，以及短期空間學習和記憶等認知能力受損表現(xiàn)，具有與創(chuàng)傷后應激障礙相似的致病因素與過程，可基本模擬其主要臨床表現(xiàn)。

主題詞：應激障礙，創(chuàng)傷后；捕食應激；情緒喚醒；動物模型

1 材料和方法

設計：隨機對照動物實驗。

單位：解放軍成都**成都總醫(yī)院神經(jīng)內科。

材料：實驗于2004- 01 /2005- 06 在解放軍成都**成都總醫(yī)院完成。選擇雄性Wistar 大鼠135 只，實驗起始體質量（185±9）g，由解放軍第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所實驗動物中心提供(許可證號：scxk-（軍）2002008)。12 h 光亮/黑暗條件、22～25 ℃ 環(huán)

境溫度，分隔喂養(yǎng)。成組設計隨機數(shù)字表法分為捕食應激組75 只及正常對照組60 只。

儀器：按文獻自制捕食應激實驗箱（1 m×1 m×1 m 鐵絲籠，中間放置20 cm×15 cm×15 cm 小鐵絲籠，便于實驗時將大鼠放入其中）。按文獻[5, 6]自制曠場行為觀察箱(60 cm×60 cm×60 cm 的無頂木盒，箱底用墨線分為36 個等份小方格。用于大鼠情緒喚醒水平檢測)。按文獻[7]制備高架十字迷宮(木質結構，包括2 個50 cm×10 cm 的相對開臂和2 個50 cm×10 cm ×40 cm的相對閉臂，閉臂的上部是敞開的。迷宮中央有10 cm×10 cm的開闊部。迷宮離地面50 cm。用于評價大鼠焦慮樣行為改變)。按文獻[8]制備Morris水迷宮(直徑1.2 m、高0.5 m 的圓桶，劃為4 個象限（按順時針方向定義為A、B、C、D），盛水后按0.5%～1.5%比例加入奶粉，使水成為不透明的乳白色，水溫控制于22～25 ℃。將直徑11 cm平臺固定于某一象限（本實驗中置于A 象限），平臺在水平面下1 cm。用于空間學習和記憶能力觀察)。

設計、實施、評估者：設計為**作者，資料收集為**、二、三作者，實施為**、二、三、四作者，評估為**、五作者。實驗實施前所有參與者均經(jīng)過相關專業(yè)統(tǒng)一培訓。

方法：

模型制備：先將大鼠放入捕食應激實驗箱的小籠中，再將1只饑餓的貓放入實驗箱中，使貓與大鼠無生理傷害性接觸，致大鼠出現(xiàn)輕微驚恐性顫動及因驚嚇所致呼吸急促而快速鼻翼煽動6～8 min，以確保實驗大鼠相似的應激強度及穩(wěn)定的應激效應。正常對照組大鼠除不接觸貓外，其他處理程序相同。

情感行為觀察：于捕食應激后1，14 d，1，2 和4 個月時分別取正常對照組及捕食應激組大鼠各12、15只，觀察其情感行為改變：①大鼠運動活性：將大鼠輕輕放入曠場行為觀察箱中央小方格內，觀測5 min 內動物的活動情況。計分標準：大鼠1 /2 以上身體從所在方格進入相鄰方格，即爬越1 次計1 分，所得總分用于評價其運動活性改變。②探究行為：方法同上，觀察5 min內大鼠后肢性站立計分改變。計分標準：后肢性站立1次計1分，總分用于評價其探究行為改變。③拒俘反應性：以動物從未接觸過的手套輕抓大鼠，觀察其反應。記分標準：0 很容易抓取動物；1 尖叫或回避；2 尖叫并回避；3 逃脫；4 逃脫并尖叫；5 咬或試圖撕咬手套；6主動躍起攻擊；以此評價動物恐懼與沖突素質特征改變[6]。④高架十字迷宮實驗：將大鼠置于迷宮中央，頭朝閉臂。分別記錄5 min 內大鼠進入開臂和閉臂的次數(shù)和在兩臂滯留時間（以四肢全部入臂或出臂為準），計算大鼠進入開臂的次數(shù)和在開臂滯留時間分別占總次數(shù)(進入開臂與閉臂次數(shù)之和）及總時間（在開臂與閉臂滯留時間之和）的百分比，以此為評價焦慮指標。

空間學習和記憶能力觀察:采用Morris 水迷宮法[8]，觀察捕食應激后第1 天，2 周時空間學習和記憶能力的改變。第1，2 天為空間覓向訓練：第1 天訓練9 次，2 min /次，記錄大鼠從不同象限入水至發(fā)現(xiàn)并爬上平臺的時間為訓練潛伏期，每3 次的均值作為平均訓練潛伏期；第2 天重復進行6 次訓練；比較所得的5 個平均訓練潛伏期變化以分析動物獲取空間信息的能力。第3 天進行空間定向能力測試：先將平臺移去，再將大鼠放入水中2 min，記錄它在四個象限中停留時間的百分比，以判斷動物記憶儲存及提取再現(xiàn)能力。

主要觀察指標：大鼠爬越行為、后肢性站立、拒俘反應性、高架十字迷宮開臂次數(shù)與開臂時間、Morris 水迷宮平均訓練潛伏期及不同象限停留時間百分比。

統(tǒng)計學分析：由成都**成都總醫(yī)院信息科統(tǒng)計室采用SPSS 9.0 軟件進行單因素或雙因素方差分析，以及各組均數(shù)的S- N- K法（用于方差齊性的大鼠爬越行為、拒俘反應及開臂次數(shù)百分比的比較）和Tamhane’sT2法檢驗（用于方差不齊性的大鼠后肢性站立、開臂時間百分比及空間學習和記憶能力改變的比較）。

2 結果

2.1 實驗動物數(shù)量分析參與實驗大鼠135只在實驗過程中無死亡，均進入結果分析。

2.2 大鼠捕食應激后不同時間情感行為觀察結果

2.2.1 大鼠捕食應激后不同時間曠場行為改變和高架十字迷宮行為改變結果。

表1 顯示，捕食應激大鼠應激后1個月內曠場爬越行為明顯減少，顯示其運動活性降低，之后漸恢復正常；而4個月時后肢性站立仍顯著減少，表明其探究行為明顯降低。捕食應激后4 個月內，應激大鼠進入開臂次數(shù)百分比和開臂滯留時間百分比均明顯降低，并于應激后1 個月時稍有恢復，但2個月后則進一步降低。

2.2.2 大鼠捕食應激后不同時間拒俘反應性結果見表2。大鼠拒俘反應性在應激后2個月內明顯增強。

3 討論【上海欣軟整理】捕食應激致大鼠的持續(xù)性情緒喚醒障礙

創(chuàng)傷后應激障礙臨床表現(xiàn)多樣，包括反復重現(xiàn)創(chuàng)傷性體驗癥狀，情感麻木與回避癥狀，警覺過強所致持續(xù)性焦慮、驚恐逃避反應及易激惹癥狀等癥候群。作者的前期工作分別建立了海馬驚厥閾下電刺激和大鼠加強捕食應激兩種創(chuàng)傷后應激障礙動物模型。雖然二者均可誘發(fā)實驗大鼠造型后1個月內創(chuàng)傷后應激障礙樣行為異常，但由于前者很難排除電刺激等影響因素的作用，且與創(chuàng)傷后應急障礙的致病因素亦有較大差異；而后者采用了捕食應激與再次環(huán)境刺激相結合的方法，很難排除2次應激效應的影響；同時，兩種模型觀察時間有限，且所用行為學研究方法的定量、定性分析不足，難以排除研究者主觀因素的影響；因此，有必要進一步改進應激模式、控制應激強度，以誘發(fā)實驗大鼠更長時程的應激相關情感行為異常，并定量分析相關情緒喚醒障礙的性質。

鑒于應激因素與強度，以及受害者當時的極度無助感在創(chuàng)傷后應激障礙發(fā)病中有重要意義，利用動物食物鏈中特殊的捕食行為，模擬與之相似的致病因素和過程。同時，通過反復試驗發(fā)現(xiàn)，捕食應激4～9 min即可引發(fā)大鼠出現(xiàn)輕微驚恐性顫動，以及因驚嚇所致呼吸急促而快速鼻翼煽動，而持續(xù)這種驚嚇狀態(tài)6～8 min（即總體應激時間在11～17 min）時，可確保實驗大鼠基本相似的應激強度及穩(wěn)定的應激效應；更有趣的是，此時的應激效應亦可能*佳，并由此引發(fā)了實驗大鼠在4 個月的觀察時間內存在明顯的情感行為障礙；而應激不足或過強、持續(xù)時間過短或過長，似均難以達到類似的效應，但應激方式和強度與應激相關情感行為異常間的關系尚不能確定，有待進一步探討。

曠場行為觀察是檢測實驗動物情緒喚醒水平的一種重要方法。動物初入陌生環(huán)境可出現(xiàn)明顯的防護性情感反應，這對于量化分析實驗動物的警覺水平、焦灼狀態(tài)、環(huán)境適應能力等有重要意義。實驗結果顯示，捕食應激大鼠應激后1個月內曠場爬越行為明顯減少，提示其新環(huán)境中運動活性顯著降低；拒俘反應性則在應激后2個月內顯著增強，顯示其受驚嚇程度嚴重、沖突特性增強、易激惹、掙扎行為明顯；而4個月時后肢性站立仍顯著減少，表明其挫折感明顯、探究行為顯著受抑。由實驗結果可見，捕食應激可致實驗大鼠在新環(huán)境中的警覺水平明顯增高、易激惹、適應能力顯著下降，在應激刺激后較長時間內一直處于驚恐逃避情感反應中。

高架十字迷宮試驗則是利用動物對新異環(huán)境的探究特性，以及對高懸敞開臂的恐懼感而形成的矛盾沖突狀態(tài)來評價實驗動物焦慮素質特征的。實驗結果顯示，捕食應激后4個月內，應激大鼠進入開臂次數(shù)百分比和開臂滯留時間百分比均明顯降低，提示捕食應激對大鼠有明顯的長時間的致焦慮效應；有趣的是，實驗大鼠焦慮情緒于應激后2 周內進行性加重，1個月時有所緩解，但2個月后則再次進一步加重，顯示嚴重心理應激所致實驗大鼠情緒喚醒障礙可能主要以焦慮相關行為為特征，與創(chuàng)傷后應激障礙患者極為相似，具體原因尚待進一步探討。

Morris水迷宮是一種研究與海馬功能直接相關的空間學習記憶模型，能較準確地反映動物的空間學習和記憶能力。在Morris 水迷宮的空間覓向訓練期，捕食應激后1 d 應激大鼠較正常對照組花費更多的時間以找尋平臺，顯示其學習和記憶的獲得與鞏固過程受到影響；而在空間定向能力測試期，應激大鼠空間定向能力亦明顯受損，顯示捕食應激可導致實驗動物記憶過程的不穩(wěn)定性，且對己儲存記憶的讀出或提取過程可能也有一定影響。而實驗后2周時兩組動物的空間學習和記憶能力并無明顯差異，提示嚴重心理應激只引發(fā)了實驗動物短期的學習和記憶能力受損，與創(chuàng)傷后應激障礙患者存在的短暫認知功能受損頗

為相似。