摘要 : 用 D- 半乳糖 (D- gal) 建立衰老動物模型且海馬內(nèi)微注射β AP ,檢測各組大鼠開場行為、 Y- 迷宮分辨學(xué)習(xí)和一次性被動回避反應(yīng)的變化的方法 ,研究β - 淀粉樣蛋白 ( β AP) 對衰老大鼠開場行為及學(xué)習(xí)記憶能力的影響. 結(jié)果是 D- gal + NS 組、 D- gal + β AP 組大鼠在新異環(huán)境中自發(fā)活動和探究行為減少 ,學(xué)習(xí)記憶減退 ,與NS + NS 組比較有顯著性差異 ( P < 0. 05 , P < 0. 01) . 該文得出的結(jié)論是β AP 與 D- gal 聯(lián)合使用可導(dǎo)致腦老化程度加重 ,學(xué)習(xí)記憶能力顯著減弱.開場實驗及Y迷宮對衰老模型大鼠的影響

關(guān)鍵詞 : β - 淀粉樣蛋白 ; 開場行為 ; 學(xué)習(xí)記憶 ; 衰老

　　 β - 淀粉樣蛋白 ( β - amyloid protein , β AP) 是老年性癡呆患者的大腦中特有的一種蛋白 , 它在老年性癡呆的發(fā)病機(jī)理中的作用已引起人們的重視. 生化研究表明 ,β - 淀粉樣蛋白是老年性癡呆患者腦海馬和皮層老年斑 ( SP) 的主要成分 , 它與 AD 的病理形成過程關(guān)系密切. 已有報道 β AP 對正常大鼠海馬神經(jīng)元的毒害作用, 但有關(guān)β AP 對衰老大鼠的作用 ,國內(nèi)外均未見報道 , 本實驗試圖在 D- 半乳糖所致衰老動物模型基礎(chǔ)上進(jìn)行海馬內(nèi)注射β AP ,觀察其對大鼠開場行為和空間分辨學(xué)習(xí)以及記憶保持能力的影響.

1 　材料與方法

1. 1 　動物和試劑

雄性健康 SD 大鼠 ,體重 100～120 g ( 江蘇省實驗動物中心提供) , β AP 為 Sigma 公司產(chǎn)品 ( β AP1 -40 ,Lot NO. 76 H49611) ,D- 半乳糖 ( D- gal) 為上海試劑二廠產(chǎn)品.

1. 2 　分組和模型建立

將大鼠隨機(jī)分成 4 組 : ①生理鹽水 NS + NS組 ; ② NS + β AP 組 ; ③ D- gal + NS 組 ; ④ D- gal + β AP組. ③、④組動物腹腔注射 D- 半乳糖 :50 mg· kg- 1·d- 1,連續(xù)注射 6 周建立衰老動物模型; ①、②組動物腹腔注射等量生理鹽水. 于第 4 周進(jìn)行雙側(cè)海

馬內(nèi)注射β AP , 每側(cè)注射 1μ L ( 4μ g/μ L ) ; 對照組注射等量生理鹽水. 海馬定位注射方法 : 大鼠腹腔注射 4 %****鈉 ( 40 mg. kg- 1) 麻醉 , 立體定位儀( 日本 NARISHI GE SN - 3 型) 上固定 , 坐標(biāo)按照圖譜, 以前囪定位 : AP = - 3. 5 mm , ML = ± 2. 0mm ,H = 2. 7 mm ,鉆開顱骨 , 用微量進(jìn)樣器垂直進(jìn)針 ,每側(cè)注射時間為 5min ,留針 5min ,緩慢起針 , 局部**后縫合皮膚 ,肌注***抗感染.

1. 3 　行為學(xué)檢測

連續(xù)腹腔內(nèi)注射 6 周后進(jìn)行.

1. 3. 1 　開場行為 (open field):

將動物置于圓形開場檢測箱底中央的格內(nèi) , 記錄其在 3 min 跑動 (locomotion) 穿過的格數(shù) ,后肢站立 ( rearing) 次數(shù)、梳理 ( groo ming) 次數(shù)及糞便顆粒數(shù). 比較不同組間大鼠在新異環(huán)境中自發(fā)行為和探究行為表現(xiàn)的差異.

1. 3. 2 　Y - 迷宮分辨學(xué)習(xí) ( Y- maze discri minationlearning) 能力檢測:

Y- 迷宮為三等分輻射式反射箱. 購自上海欣軟信息科技有限公司，以大鼠被電擊后逃至**區(qū)為一次正確反應(yīng) ,連續(xù) 10 次測試中有9 次 ( 90 %) 正確反應(yīng) , 定為學(xué)會標(biāo)準(zhǔn). 記錄每個大鼠達(dá)到學(xué)會標(biāo)準(zhǔn)的訓(xùn)練次數(shù). 所有檢測過程均由計算機(jī)完成.

1. 3. 3 　一次性被動回避反應(yīng) ( one- trial passiveavoidance res ponse):

根據(jù)大鼠趨暗習(xí)性 , 記錄其在通道上的停留時間 ,即步入潛伏期 ( step- through latency , STL ) ; 動物進(jìn)入暗箱后立即給予電擊 ( 0. 3 mA ,5 s) ;24 h 后檢測大鼠的 STL . 以 STL 作為記憶保持的指標(biāo) ,STL越長表明對電擊的記憶保持越好. 檢測以 240 s 為限.

本實驗數(shù)據(jù)用 ( X ±SŠ X( X 表示 , 組間差異用 t檢驗 ; 一次性被動回避反應(yīng)采用 Mann- whitney 非參數(shù)檢驗.

2 　結(jié) 　　果

2. 1 　不同組大鼠開場行為觀察

統(tǒng)計處理表明 ,在開場行為諸參數(shù)中 ,D- gal + β AP 組動物與 NS + NS 組比較糞便顆粒數(shù)有顯著性差異 ( P < 0. 05) , 而跑動格數(shù)則極明顯減少 ( P < 0. 01) , 前者在新異環(huán)境中自發(fā)活動和探究反應(yīng)明顯下降 ,緊張恐懼狀態(tài)也降低. D- gal + NS組動物跑動格數(shù)與 NS + NS 組比較也有顯著性差異 ( P < 0. 05) . NS + NS 組與 NS + β AP 組之間雖無顯著性差異 , 但其跑動格數(shù)、站立次數(shù)均有下降趨勢 ,說明β AP 單獨使用對大鼠在新異環(huán)境中的自發(fā)活動及探究行為也有一定影響.

2. 2 　 Y- 迷宮分辨學(xué)習(xí)能力檢測

達(dá)到學(xué)會標(biāo)準(zhǔn)所需訓(xùn)練的次數(shù) , NS + NS 組 :21. 4 ± 2. 6 ;NS + β AP 組 :34. 6 ± 5. 5 ;D- gal + NS 組 :42. 4 ± 5. 4 ;D- gal + β AP 組 :48. 0 ± 5. 6. 前兩者比較無顯著性差異 ( P > 0. 05) ,D- gal + NS 組與 NS + NS組比較有顯著性差異 ( P < 0. 05) , 而 D- gal + β PA 組與 NS + NS 組比較 ,達(dá)到學(xué)會標(biāo)準(zhǔn)所需訓(xùn)練次數(shù)極明顯增加 ( P < 0. 01) ,說明 D- gal 所致衰老模型大鼠的分辨學(xué)習(xí)能力顯著降低 , 而在衰老動物模型上海馬內(nèi)注射β AP 更使學(xué)習(xí)能力極顯著下降.

2. 3 　一次性被動回避反應(yīng)

 D- gal + β AP 組記憶保持能力明顯下降 ,電擊后 24 hSTL 顯著縮短 , 與 NS + NS 組和D- gal + NS 組比較有顯著性差異 ( P < 0. 05) . 其他組之間比較 ,差異無顯著性 ,但記憶保持能力呈逐漸降低趨勢.

3 　討 　　論

有研究報道 ,對大鼠連續(xù)注射 D- 半乳糖引起擬衰老效應(yīng), 可導(dǎo)致動物學(xué)習(xí)記憶能力下降 , 腦內(nèi)超氧陰離子自由基水平增高 , 超氧化物歧化酶( SOD) 活性降低 , 丙二醛和脂褐素含量升高. 這說明 D- 半乳糖誘發(fā)的自由基蓄積引起的脂質(zhì)過氧化損傷 ,是產(chǎn)生擬衰老變化的原因 ,這必然也會引起衰老性腦功能的衰退.β AP 是老年性癡呆患者*早出現(xiàn)的典型的病理學(xué)特征. 一些學(xué)者認(rèn)為 , β AP 可引起學(xué)習(xí)記憶減退、認(rèn)知障礙等,是 AD 各種病理和臨床表現(xiàn)的始發(fā)因素. β AP 具有沉積作用和神經(jīng)毒性 , 開場實驗及Y迷宮對衰老模型大鼠的影響 較高濃度的β AP 能引起神經(jīng)退化和死亡; β AP 的神經(jīng)毒性作用可以增強(qiáng)或加大各種傷害性刺激的細(xì)胞損傷效應(yīng) ,此外它還具有直接的細(xì)胞毒性. 但 Morimoto報道 ,在大鼠海馬神經(jīng)元 , 單獨注射β AP 不能產(chǎn)生特定的神經(jīng)毒性作用 , 僅能引起少量的神經(jīng)元變性. 無論在體外培養(yǎng)細(xì)胞 , 還是在體內(nèi)研究中 ,β AP 是否具有神經(jīng)毒性作用還存在著爭議 , 其原因可能是所用β AP 的濃度不同所致. 本研究結(jié)果表明海馬內(nèi)單獨注射β AP 不能引起明顯的行為學(xué)變化 ,但在衰老動物模型基礎(chǔ)上經(jīng)β AP 處理后 , 可導(dǎo)致動物自發(fā)活動及學(xué)習(xí)記憶行為明顯降低 , 說明D- 半乳糖和 β AP 有疊加效應(yīng). 學(xué)習(xí)記憶是腦的**功能 ,學(xué)習(xí)記憶減退是腦功能衰退的表現(xiàn). 因此 ,本實驗結(jié)果提示 , 在 D- 半乳糖所致衰老動物基礎(chǔ)上 ,海馬內(nèi)注射β AP ,可望作為更接近 AD 的一種動物模型. 但它是否具有 AD 的各種病理學(xué)特征 , 還有待于做進(jìn)一步研究.