摘 要 目的:用脂多糖( lipopolysaccharide，LPS) 建立阿爾茨海默病( Alzheimer's disease，AD) 炎癥模型大鼠，觀察淫羊藿苷( Icariin ICA) 對該模型大鼠學習記憶及超微結構的影響。方法: 經八臂迷宮訓練成功的 45 只雄性 Wistar 大鼠隨機分為對照組、模型組、淫羊藿苷 30mg/kg 組、淫羊藿苷 120mg/kg 組、雙氯芬酸組10mg/kg 組，采用側腦室注射 LPS( 10μl) 制作實驗性 AD 炎癥模型，并八臂迷宮測驗并記錄其數(shù)據(jù)。迷宮測驗完成后斷頭取腦海馬組織。應用電鏡觀察大鼠海馬組織CA1 區(qū)神經細胞超微結構變化，用 SPSS 統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計學分析。結果: ⑴側腦室注射 LPS( 10μl) 后對大鼠一般情況觀察出現(xiàn)了行為異常。⑵八臂迷宮測試系統(tǒng)分析結果: 制模后與對照組相比，其它各組大鼠總記憶錯誤( TE) 、參考記憶錯誤( ＲME) 、工作記憶錯誤( WME) 明顯增多，用淫羊藿苷**后與模型組比較，淫羊藿苷 120mg/kg 組和雙氯芬酸組 10mg/kg 組大鼠的 TE、ＲME、WME 均明顯減少，淫羊藿苷 30mg/kg組錯誤選擇次數(shù)無統(tǒng)計學意義。超微結構觀察示: 對照組、海馬組織線粒體比較規(guī)則，淫羊藿苷 120mg/kg 組、雙氯芬酸組線粒體輕度受損，模型組海馬神經細胞核固縮，核周隙擴張，甚至核膜結構不清，核形態(tài)極不規(guī)則。結論: 側腦室注射LPS( 10μl) 能成功復制AD 炎癥動物模型; 淫羊藿苷 120mg / kg 組顯著改善 AD 模型大鼠的學習記憶能力，淫羊藿苷對炎癥模型大鼠海馬超微結構有保護作用。

關鍵詞 淫羊藿苷; 阿爾茨海默病炎癥模型; 電子顯微鏡; 超微結構

阿爾茨海默病( Alzheimer's disease，AD) 是一種常見的**神經系統(tǒng)退行性**，表現(xiàn)為進行性的記憶和認知功能的下降，行為異常和社交障礙。其發(fā)病機制有很多學說，其中炎癥機制受到廣泛關注。眾多研究表明****是**阿爾茨海默病的一種潛在**方案并研究提示**可改善 AD 病理改變。應用脂多糖可誘導阿爾茨海默病炎癥模型大鼠模型。淫羊藿甙具有**，抗氧化等多種生物學活性。基于以上理論，聯(lián)系阿爾茨海默病的炎癥機制和淫羊藿的**作用本實驗目的是建立脂多糖誘導的 AD 炎癥模型大鼠，通過八臂迷宮測驗淫羊藿苷對該模型大鼠學習記憶能力的影響，用電鏡觀察海馬組織 CA1 區(qū)的超微結構并探討及其作用機制。

1 材料與方法

1． 1 試驗** 淫羊藿苷 ( ICA) 西安小草植物科技有限責任公司，批號: XC071223，純度 ＞98% ( HPLC) 。

1． 2 動物 普通成年雄性 Wistar 大鼠 45 只，體重 220 ～ 280g，購自內蒙古大學實驗動物中心，均為清潔級動物，動物合格證號為: SCXK( 蒙) 2002-0001 ，分組分籠飼養(yǎng)，充分光照，每 12 小時明暗交替，( 光照時間: 8∶ 00 ～20∶ 00) 控制室溫 18-21℃ ，標準飼料喂養(yǎng)，自由飲食，使其體重控制在自由進食體重的 80%～ 85% 。適應性喂養(yǎng) 3 天。

1． 3 試劑 脂多糖 ( LPS) 美國 SIGMA 公司，批號: 127K4048貨號: L2880。

1． 4 儀器 八臂迷宮分析測試系統(tǒng)( 上海欣軟信息科技有限公司) ，腦立體定位儀( 上海欣軟信息科技有限公司) ，H-600 型透視電鏡( 日本株式會社產品)

1． 5 方法 八臂迷宮動物空間記憶測試是研究認知功能機制的*常用方法之一，本研究也采用放射狀八臂迷宮( 四臂放食物) 訓練 Wistar 大鼠，以建立一種有效評價淫羊藿對大鼠空間記憶影響。在進行放射狀八臂迷宮實驗前限制大鼠禁食，不限制飲水，維持其體重原體重的 80% ～ 85%。行為學觀察均在10∶ 00 ～ 17∶ 00 進行。訓練前大鼠先在迷宮中適應 2 d，每天2 次。適應時 3 ～ 4 只大鼠同時置于迷宮中，自由活動和攝取食物 10 min。適應后進行每天 2 次的訓練。每次訓練中，八臂中只有四臂放置了食物( 分別為 1、3、4 和 6 號臂) ，整個實驗過程均維持此順序。大鼠放在迷宮中央?yún)^(qū)，此時中央?yún)^(qū)四周用門關住 15 s 將門打開，大鼠可選擇進入任意一臂攝取食物，測試定時3 分鐘。大鼠進入有食物的臂且攝取了食物為 1 次正確選淫羊藿苷對阿爾茨海默病炎癥模型大鼠神經細胞的保護作用擇，否則為錯誤選擇。記錄參數(shù)為錯誤選擇的次數(shù)。重新進入放食物臂稱工作記憶錯誤( working memory error，WME) ，進入不放食物臂稱為參考記憶錯誤( reference memory error，ＲME) 。兩者之和為總記憶錯誤( total error，TE) 。連續(xù) 5 次訓練總錯誤選擇次數(shù)為1 次或1 次以下，認為訓練成功。ＲM-200 八臂迷宮分析測試系統(tǒng)采用紅外探測的方式跟蹤大鼠的行為，采用微電腦控制，可自動得出測定結果。八臂迷宮訓練成功的 Wistar 大鼠 45 只隨機分為 5 組，分別為對照組、模型組、淫羊藿苷 30mg/kg 組、淫羊藿苷 120mg / kg 組、雙氯芬酸鈉 10mg / kg 組，每組淫羊藿苷對阿爾茨海默病炎癥模型大鼠神經細胞的保護作用

Wistar 大鼠 9 只。大鼠八臂迷宮訓練成功后次日通過側腦室注射 LPS 溶液誘導 AD 炎癥模型，具體方法如下: 3% ****鈉40 ～ 50mg / kg 腹腔注射，麻醉大鼠，將鼠頭固定于腦立體定位儀上保持前后囪在同一水平，剪開頭頂部毛發(fā)，碘酊**后切開皮膚，按照 George Paxinos《大鼠腦立體定位圖譜》進行定位，選擇右側側腦室為注射靶區(qū)在前囪點后方 1． 0 mm，中線旁開 1．6mm，用柔性顱骨鉆鉆一小孔，用微量注射器緩慢自腦表面垂直進針深度為 3． 4mm( 達側腦室) ，將 5ug/ul LPS 溶液 10μl 緩慢注入，留針 2min 后緩慢撤針，縫合切口。對照組注入等體積無菌性生理鹽水。造模后**天始用藥結束止分別通過八臂迷宮實驗觀察大鼠的空間記憶能力，以判定模型的成敗和**的療效。八臂迷宮測試系統(tǒng)記錄分析大鼠的 ＲME 、WME、TE 每只大鼠測試兩次，取平均值進行統(tǒng)計分析。

1． 5． 1 給**法

對照組: 大鼠側腦室注射生理鹽水后次日起，蒸餾水連續(xù)灌胃 14 天，方法為用灌胃針將蒸餾水按 1ml/100g( 大鼠體重) 灌入大鼠胃內，1 次 / d; AD 模型組: 大鼠 AD 模型制備后次日起，蒸餾水連續(xù)灌胃 14 天，方法同上，1 次/d; 淫羊藿苷 30mg/kg 組: 大鼠 AD 模型制備后次日起淫羊藿苷30mg / kg，連續(xù)灌胃 14 天，方法為用灌胃針將淫羊藿苷混懸液( 配制 ICA 濃度為 0． 3%) 1ml/100g 灌入大鼠胃內，1 次/d; 淫羊藿苷 120mg/kg 組: 大鼠 AD 模型制備后次日起，淫羊藿苷120mg / kg 連續(xù)灌胃 14 天，方法同上，1 次 / d; 雙氯芬酸組: 大鼠AD 模型制備后次日起，雙氯芬酸鈉( 配制雙氯芬酸鈉濃度為 0．1% ) 10mg / kg 連續(xù)灌胃 14 天，方法同上，1 次 / d; 雙氯芬酸鈉給藥劑量參照人的給藥劑量，按體重、體形系數(shù)算出。八臂迷宮測試完成后 24h 內用 2% ****鈉腹腔麻醉( 40 ～50mg/kg) 快速取腦后分離海馬組織，液氮保存。

1． 5． 2 電鏡標本的制作及大鼠海馬超微結構的觀察 每組隨機選取 3 只大鼠，10% 水合氯醛麻醉后，快速取腦，并將取出的腦組織置于冰上，分離海馬，3% 戊二醛中 4℃ 冷藏，經過清洗、后固定、脫水、浸透、包埋聚合，光鏡下定位 ，選取海馬 CA1 區(qū)富含神經元部位制成超薄切片( 70nm) ; 經醋酸鈾電子染色劑染色后置于透射電鏡下觀察并拍照。淫羊藿苷對阿爾茨海默病炎癥模型大鼠神經細胞的保護作用

1． 6 統(tǒng)計學處理 采用 SPSS 13． 0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。描述性資料以( x ± s) 表示，計量資料經齊性檢驗方差齊采用單因素方差分析，組間比較用 LSD 法，檢驗水準 a =0． 05。

2 結果

2． 1 一般情況觀察 模型組與其它組比較，大鼠活動減少，體毛少澤，神情呆滯，反應欠靈，食欲減退。

2． 2 八臂迷宮實驗結果

制模前每只大鼠的總記憶錯誤≤1，分組并制模后與對照組比較其它各組大鼠記憶能力明顯減低，總記憶錯誤、參考記憶錯誤、工作記憶錯誤顯著增多，表明側腦室注射脂多糖后大鼠的記憶能力明顯受損，阿爾茨海默病模型制作成功。**后與模型組比較，淫羊藿苷 120mg/kg 組和雙氯芬酸組總記憶錯誤、參考記憶錯誤、工作記憶錯誤顯著減少，淫羊藿苷 30mg/kg 組總記憶錯誤、參考記憶錯誤、工作記憶錯誤無統(tǒng)計學意義，淫羊藿苷 120mg/kg 組和雙氯芬酸組比較總記憶錯誤、參考記憶錯誤、工作記憶錯誤無統(tǒng)計學意義。

2． 3 電鏡觀察海馬超微結構結果 對照組大鼠海馬區(qū)神經細胞線粒體規(guī)則，核呈圓形或橢圓形，核膜雙層結構清晰，核內染色質分布均勻，可見核孔、單個或兩個核仁，細胞質內含各種細胞器及包涵物、排列有序。線粒體大小及形態(tài)正常，內嵴清晰可見，基質均勻，粗面內質網散在分布，神經氈內突觸結構正常。見圖 1，2。淫羊藿苷 30mg/kg 組神經細胞損傷較重，線粒體嵴斷裂，呈空泡化改變，胞質內可見脂褐素顆粒沉積，但核膜清楚，見圖 3，4 。模型組可見大鼠海馬 CAI 區(qū)神經細胞嚴重損傷，稀疏少見，神經細胞形態(tài)不規(guī)則，變形，胞膜皺縮，胞體縮小，胞漿濃縮，細胞器稀疏，線粒體數(shù)目明顯減少，線粒體靖排列紊亂，甚至斷裂消失，神經細胞核固縮，核膜結構不清，核形態(tài)不規(guī)則，有切跡，核偏位，線粒體腫脹，可見嵴斷裂，空泡形成。見圖 5，6。淫羊藿苷 120mg/kg 組大鼠海馬內神經細胞損傷較輕，為神經元胞體較大，核圓，核膜清晰，核仁明顯; 胞質內細胞器較豐富; 排列有序，神經氈內突起結構正常，突觸數(shù)量較多。見圖 7，8。雙氯芬酸組大鼠海馬內結構基本正常，突觸前膜內突觸小泡較清晰 ，神經細胞內細胞器較多，排列較整齊。

3 討論

3． 1 阿爾茨海默病的驗證機制及淫羊藿苷的**作用 據(jù)報道炎癥與阿爾茨海默病的發(fā)病有關。在阿爾茨海默病患者腦中，Aβ 肽可引起炎癥反應而致神經元喪失和認知功能障礙。研究證實 Aβ 可激活膠質細胞而引起炎癥反應。體外研究發(fā)現(xiàn)，激活的膠質細胞可通過炎癥介質，如白細胞介素 1( IL-1) 、化學因子及神經**物質而引起神經毒作用。IL-1 也可進一步引起其他神經因子的表達，如白細胞介素 6( IL-6)。在

膠質細胞和神經元內，有與炎癥有關的酶，如 P38 分裂素激活蛋白激酶( p38mitogen-activated protein kinase，p38 MAＲK) 和環(huán)氧化酶 2( cyclooxygenase-2，COX-2) 可被激活而導致神經元損害。尸檢已證實，在 AD 患者腦中存在參與炎癥過程的補體蛋白、細胞因子及蛋白酶。還有研究發(fā)現(xiàn)腦部淀粉樣蛋白周圍的炎癥減輕使神經元存活率明顯上升。

迄今為止，AD 尚無特效**方法和**。目前** AD 的主要**包括乙酰膽堿酯酶抑制劑、腦細胞代謝激活劑、腦血循環(huán)促進劑、神經營養(yǎng)藥、雌**以及抗氧化劑等。****源于 AD 的炎癥假說。*近研究顯示 tao 蛋白及神經炎癥反應在AD 發(fā)病中占有重要地位，并把神經炎癥機制作為防治 AD 的重要靶點。

流行病學資料表明長期用 NSAIDs 能降低 AD 發(fā)生的危險性，由于長期服用甾體類**藥副作用較大且對患者的記憶力有損害，這就限制了廣泛用于預防 AD 的應用。所以既有**作用，副作用又小的**是當前研究的焦點。本實驗應用NSAIDs 雙氯芬酸鈉作為對照組發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷 120mg / kg 組與雙氯芬酸鈉作用相當，并淫羊藿苷是傳統(tǒng)中藥副作用小，對其作用的機制可能也是**作用，本實驗根據(jù)炎癥機制給大鼠側腦室注射 LPS 誘導產生 AD 炎癥模型。并用八臂迷宮測試系統(tǒng)測試后結果與對照組比較模型組 WME，ＲME，TE 顯著增高;表明比較成功的復制了 AD 炎癥模型。淫羊藿是一種**有效的天然****，其部分機制是可能的多重聯(lián)系的親炎癥細胞因子的干預( 腫瘤壞死因子-α 和 IL -6) ，炎癥介質( NO) 和粘附分子( 表面 CD11b) 。近期國外對淫羊藿苷的研究表明淫羊藿苷可保護 LPS 誘導的軟骨細胞炎癥和細胞外基質降解。

3． 2 淫羊藿苷對海馬超微結構的影響 1931 年德國科學家研制出了世界上**臺透射電子顯微鏡，為人類認識細胞的超微結構奠定了基礎。細胞超微結構的觀察，對于研究**的病理生理變化有著非常重要的意義。為了更深入的了解 AD 的病理變化，我們選用透射電鏡觀察該模型海馬 CAI 區(qū)神經細胞超微結構的變化。通過觀察發(fā)現(xiàn)，對照組線粒體形態(tài)結構基本正常。( 見圖 1，2) 羊藿苷 30mg/kg 組和模型組，大鼠海馬 CA1 區(qū)神經細胞器的結構均表現(xiàn)出不同程度的損傷，尤其以線粒體的腫脹、空泡化、可見嵴斷裂，空泡形成，粗面內質網擴張、脫顆粒為突出表現(xiàn)，而這種損傷改變以 模型組更為嚴重淫羊藿苷 120mg/kg 組和雙氯芬酸組與對照組相比較，線粒體的結構也有輕度的損傷。但細胞器豐富，排列規(guī)則。推測大鼠的學習記憶能力的下降很可能是由于神經細胞受到損傷間接造成的。而淫羊藿苷 120mg/kg 組可有效保護及修復神經細胞超微結構。

本實驗用脂多糖成功復制出阿爾茨海默病炎癥模型大鼠，淫羊藿苷**后用電鏡觀察其超微結構顯示淫羊藿苷對炎癥模型大鼠有很好的保護作用，其機制是否是**有關目前尚未證實，這將是我們下一步工作的重點。