目的：穿梭實驗系統(tǒng)比較不同缺血再灌注時間對短暫性大腦中動脈閉塞（transient middle cerebral artery occlusion, tMCAO）大鼠的運動及認知功能的影響。

方法：取穿梭箱主動回避率超過70%的大鼠60 只隨機分為4 組：根據(jù)Bederson 評分及存活率缺血再灌注60min 組（n=8）、90min組（n=11）、120min組（n=7）及假手術組（n=7）納入*終行為學研究。術后28 天行TTC染色計算梗死體積。于術后第1、3、7、14、21、28 天進行改良神經(jīng)功能缺損程度（mNSS）評分，第3、7、14、21、28 天進行前肢抓握力測試；于術后第14、21、28天進行穿梭箱測試。

結(jié)果：缺血再灌注時間越長，大鼠的生存率越低（χ2=12.694，P=0.005）；梗死體積隨缺血再灌注時間增加而增大（F=14.056，P=0.01）。缺血時間越長，mNSS評分越高（F=9.100，P=0.001）；梗死組較假手術組抓握力量減?。?/span>F=11.630，P＜0.05）；穿梭箱實驗顯示各時間點90min組主動回避率較假手術組降低（P＜0.05），120min組第14、21 天時較假手術組主動回避率降低（P＜0.05）。

結(jié)論：tMCAO大鼠隨缺血再灌注時間延長，運動功能障礙嚴重程度增加，缺血60min 再灌注不出現(xiàn)認知功能障礙，且因運動功能自發(fā)性恢復速度快，不適用于認知功能及長期運動功能行為學測試。缺血90min、120min出現(xiàn)認知功能障礙。

關鍵詞 ： 短暫性大腦中動脈閉塞；缺血再灌注；運動；認知

我國每年有新發(fā)腦卒中患者約200 萬人，腦卒中已成為我國的主要致殘病因[1]，腦卒中后常見的問題包括運動、吞咽、言語、認知功能障礙等。卒中后認知功能障礙（post stroke cognitive impairment,PSCI）的發(fā)病率高達64%且長期存在[2]，嚴重影響其他功能的康復，因而對認知障礙的研究尤為重要。目前腦卒中相關動物模型有多種，但大多數(shù)是針對運動功能障礙，而認知功能障礙動物模型較少。短暫性大腦中動脈閉塞（transient middle cerebralartery occlusion, tMCAO）能很好地模仿人類因血管閉塞引起的腦梗死這一**發(fā)病模式，常被用于認知功能相關研究，但tMCAO模型是否會出現(xiàn)認知功能障礙仍有一定爭議，且各實驗室對缺血再灌注時間的選擇不一，具有一定隨意性，常見的缺血時間為120min、90min、60min[4]，不同缺血再灌注時間對tMCAO大鼠的運動及認知的影響有何區(qū)別，少有研究涉及。本研究就不同缺血再灌注時間對大鼠的運動及認知功能的影響進行研究，為今后tMCAO模型相關實驗的缺血再灌注時間選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物：SPF 級雄性SD 大鼠60 只，體重235—255g，由廣東中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供，許可證號：SCXK（粵）2013-0034，所有動物均飼養(yǎng)于中山大學（生命科學學院中藥與海洋**實驗室）SPF 級實驗環(huán)境中，許可證號：SYXK（粵）2014-0020，采用已**顆粒型大鼠飼料喂養(yǎng)，飲用****水，環(huán)境溫度控制在20—25℃。

1.1.2 主要儀器與試劑：YLS-13A大小鼠抓力測試儀（上海嘉適科學儀器有限公司），XR-XC105 型（上海欣軟信息科技有限公司）穿梭實驗視頻分析系統(tǒng)（Shuttlebox system），4—0 硅膠包被線栓（直徑0.37±0.02mm）（深圳瑞沃德生命科技有限公司），2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC，美國Sigma）。

1.2 實驗方法

1.2.1 穿梭箱實驗：采用XR-XC105 型穿梭實驗視頻分析系統(tǒng)，穿梭箱內(nèi)部（226×213×350）mm，底部設不銹鋼柵欄，使用電流作為非條件刺激，電擊動物足底部。頂部設噪聲發(fā)生器（聲音）及兩側(cè)各有一光源作為條件刺激。適應5min 消除探究反射后予光聲刺激5s，繼予電擊10s，間隔10s 后進入下一輪。

若在**刺激5s 內(nèi)大鼠逃向**區(qū)，則為主動回避反應，系統(tǒng)自動停止當次訓練；如果在**刺激5s內(nèi)大鼠未逃向**區(qū)，則給予0.5mA 交流電刺激10s，在電擊后逃向**區(qū)為被動回避反應陽性，否則為無反應。每只大鼠測試20 次，系統(tǒng)自動記錄主動回避反應次數(shù)（active avoidance response,AAR）、被動回避反應次數(shù)（positive avoidance response,PAR）、總回避反應（general avoidance response,GAR）為AAR+PAR，AAR與總測試次數(shù)的比值為主動回避率（active avoidance responserate, AARR）。SD大鼠預訓練5 天，每天20 次，選擇*后2 天主動回避率超過70%的進行下一步實驗，并于術后14、21、28 天測試，以AARR為檢測指標，反映大鼠的學習記記憶能力及執(zhí)行決策能力。

1.2.2 實驗動物模型制作：將預訓練達標的SD 大鼠，予以10%的水合氯醛（4ml/kg）腹腔注射麻醉，局部**備皮，頸部正中切口2—2.5cm，分離頸總動脈（CCA），預置縫線備用，沿左側(cè)CCA 分離頸外（ECA）、頸內(nèi)動脈（ICA），結(jié)扎并游離ECA 及CCA近心端。微血管夾夾閉CCA 遠心端，于CCA 兩端之間處剪一小口，將制備好的直徑為0.375mm尼龍線沿切口輕輕插入，松開微血管夾并將尼龍線輕輕插入ICA，直到稍感阻力，若尼龍線插入深度為10mm，則考慮線栓插入翼顎窩，往后退一點，稍提起ECA，使之成直線，再往里插線栓，直到再次感覺到阻力，結(jié)扎CCA遠心端，將尼龍線外留1cm 以備拔線栓時使用，根據(jù)分組不同隨機分為線栓插入60min、90min、120min 后拔出。假手術組大鼠麻醉同上，但只暴露、分離結(jié)扎血管，而不插線栓。

1.2.3 模型評價：采用改良的Bederson 評分方法進行神經(jīng)功能評分：0 分：無神經(jīng)功能缺失體征；1 分：提尾時損傷對側(cè)前肢屈曲；2 分：前肢屈曲及對側(cè)抵抗力下降；3 分：向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；4 分：向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈及意識障礙；5 分：死亡。神經(jīng)功能評分1—3 分的大鼠納入本研究，*終60min 組8 只，90min 組11 只，120min組7只，假手術組7只納入研究。

1.2.4 改良大鼠神經(jīng)功能缺損評分（modified neurologicalseverity scores, mNSS）[7]：該評分包括運動功能、感覺功能和反射缺失3 大項，共計18 小項。未能完成該項檢查或反射缺失計1 分。10—18 分為嚴重損傷，5—9 分為中度損傷，1—4 分為輕度損傷，于術后第1、3、7、14、21、28天進行評分。

1.2.5 抓握力測試：采用YLS-13A大小鼠抓力測定儀測試大鼠的抓力，將大鼠放置在抓力板上，抓住鼠尾輕輕向后牽拉，待大鼠抓牢抓力板后，均勻用力后拉，致使動物松爪，儀器自動記錄大鼠的*大抓力，將儀器與PC機聯(lián)機讀取數(shù)據(jù)進行處理。評價右側(cè)癱瘓前肢抓力的強度時，要用膠帶包裹左側(cè)未癱瘓前肢。每次測試抓力5 次，取平均值，于術后第3、7、14、21、28天進行測試。

1.2.6 TTC 染色：于第28 天取大鼠水合氯醛（4ml/kg）腹腔注射麻醉固定，開胸暴露心臟，從心尖處插入導管，先快后慢灌注生理鹽水200ml，置于-80℃冰箱5min，再于腦槽中取冠狀面均勻切成2mm厚腦片，取5 片放入2%的TTC 溶液（37℃）避光中染色20min，4%甲醛緩沖液固定。24h 后用相機拍照，其中粉紅區(qū)為正常腦組織，白**為梗死區(qū)（見圖2）。采用Image-Pro Plus 6軟件計算梗死體積分數(shù)，計算公式為梗死體積/（梗死體積+未梗死體積）×100%。

1.3 統(tǒng)計學分析

應用SPSS 20.0 進行數(shù)據(jù)分析，mNSS、抓握力量結(jié)果以平均值±標準差表示，穿梭箱實驗結(jié)果以平均值±標準誤表示。mNSS、抓握力量、穿梭箱實驗采用重復測量設計的方差檢驗，若有交互效應，各時間點進行單因素方差分析，各時間點各組之間用LSD-t 檢驗進行兩兩組間比較，腦梗死體積采用單因素方差分析，各組之間用LSD-t 檢驗進行兩兩組間比較，各組生存率采用log-rank檢驗分析比較。

2 結(jié)果

2.1 生存率比較

實驗大鼠隨缺血再灌注時間的延長，生存率降低（χ2=12.694，P=0.005），見圖1。死亡主要集中在造模后的前7 天，死亡原因包括蛛網(wǎng)膜下腔出血、癲癇、進食障礙等。因死亡、Bederson 評分不達標*終每組入組大鼠數(shù)量不同。

2.2 梗死體積的比較

實驗組大鼠隨缺血再灌注時間延長，梗死體積變大（F=14.056，P=0.01），90min、120min 組與60min組比較有顯著性差異（P＜0.05），90min、120min 組多為皮質(zhì)及皮質(zhì)下梗死，而60min 組多為皮質(zhì)下基底核區(qū)梗死。

2.3 改良神經(jīng)功能缺損程度評分結(jié)果

缺血再灌注各組均有不同程度的運動、感覺功能障礙，缺血時間越長，mNSS評分越高（F=9.10，P=0.001），各組隨觀察時間的延長，運動、感覺功能逐漸改善（F=187.87，P＜0.01），前7 天恢復*快，后恢復速度減緩（見表1，圖3）。

2.4 缺血再灌注時間對大鼠患側(cè)前肢抓握力量的影響造模后缺血再灌注各組患側(cè)前肢抓握力均有不同程度降低（F=11.630，P＜0.01），隨時間緩慢恢復（F=120.780，P＜0.01），缺血時間越長，恢復所需要的時間越長，60min 組在第7 天即恢復正常，與假手術組比較差異無顯著性意義（P＞0.05），90min 組第28天與假手術組比較差異無顯著性意義。

2.5 穿梭箱實驗結(jié)果

重復測量方差分析各組之間比較（F=3.516，P＜0.05），無時間、交互效應（P＞0.05）。進一步兩兩比較，與假手術組相比，90min 組主動回避率在各時間點都有明顯降低（P＜0.05），而120min 組也較假手術組有降低，在第14、21 天時差異有顯著性意義（P＜0.05），第28 天時差異無顯著性意義（P=0.052），60min組在各時間點與假手術組無顯著性差異（P＞0.05），見圖5。

3 討論

大鼠MCAO模型問世已經(jīng)超過三十年，應用越來越廣泛。線栓法大腦中動脈梗死模型因其與人類因血管閉塞引起的腦梗死發(fā)病模式*類似、可重復性好等優(yōu)點，成為近年來神經(jīng)實驗*常用的模型之一，在腦梗死后神經(jīng)保護研究中有超過40%采用了線栓法大腦中動脈梗死模型，而不同的缺血再灌注時間對于運動、認知功能的影響有何區(qū)別尚不清楚。本研究采用行為學實驗對不同缺血再灌注時間tMCAO 大鼠的運動、感覺、認知功能進行了4 周的檢測，為今后tMCAO大鼠相關行為學檢測實驗，特別是認知功能行為學檢測選擇缺血再灌注時間及檢

測時間提供參考。

本研究發(fā)現(xiàn)tMCAO大鼠的缺血再灌注時間越長，mNSS 評分越高，患側(cè)前肢的抓握力量越差，提示tMCAO 大鼠運動、感覺功能損傷程度受缺血再灌注的時間的影響，與既往研究一致，梗死大鼠運動功能術后1 周內(nèi)改善的速度較快，隨后速度逐漸減慢，與人類卒中的恢復類似，且缺血再灌注時間越長所需要恢復到正常水平的時間越長。60min 組在1周后運動功能改善接近于假手術組，可能的原因是缺血時間短，損傷程度輕，其次可能是缺血60min 后再灌注大部分是皮質(zhì)下基底核區(qū)梗死，而皮質(zhì)下梗死的恢復速度也更快，因而60min缺血再灌注時間不適用于對大鼠長期運動功能相關的行為學實驗。

人類腦梗死3 個月后有62.6%出現(xiàn)血管性認知功能障礙，而大鼠的MCAO模型是否會出現(xiàn)認知功能障礙及其可能的機制仍然未明確。有研究認為MCAO模型僅會有運動功能障礙而不會出現(xiàn)認知功能障礙，多數(shù)研究顯示MCAO模型大鼠存在認知功能障礙[13—14]，亦有分析認為，運動功能障礙影響了大鼠在行為學實驗中的表現(xiàn)，從而出現(xiàn)認知功能障礙的假陽性結(jié)果[15]。記憶在認知功能中有著舉足輕重的作用，一般認為與記憶密切相關的海馬主要由大腦后動脈供血，理論上MCAO不會造成海馬的損傷，但實際研究發(fā)現(xiàn)，線栓法MCAO會在一定程度上減少海馬的血流量，造成一定的損傷。此外由于梗死后顱內(nèi)壓增高、水腫、炎癥等原因海馬神經(jīng)元會發(fā)生遲發(fā)性死亡，且隨時間的進展，神經(jīng)元死亡的數(shù)量增加，這也在某種程度上解釋了為什么認知功能障礙出現(xiàn)的較晚，且進展性加重。也有研究認為[18]，tMCAO模型海馬γ-氨基丁酸抑制性神經(jīng)元的上升，細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶激活的下調(diào)，導致長時程增強受到抑制，因而出現(xiàn)認知功能障礙并呈進展性。某些皮質(zhì)損傷，如新皮質(zhì)、額葉皮質(zhì)，也是認知功能障礙出現(xiàn)的原因。部分由梗死灶單獨解釋不了的認知功能障礙，可能是因為雙側(cè)大腦的N-甲基-D-天冬氨酸受體的長期的下調(diào)和內(nèi)吞所導致的。

既往對MCAO大鼠認知功能研究多采用水迷宮檢測大鼠的空間記憶能力，但對大鼠的運動功能及體能要求較高，且浸入水中可能引起***或其他應激效應，與腦損害或藥理學操作間的相互作用具有不確定性，而穿梭箱實驗主要研究大鼠的學習記憶能力及執(zhí)行決策能力，相比水迷宮對大鼠的運動功能要求相對較小，抗外界環(huán)境干擾能力強。本研究顯示缺血90min、120min 后再灌注的大鼠的穿梭箱主動回避率降低，提示大鼠出現(xiàn)學習記憶相關認知功能的損害，但并沒出現(xiàn)明顯的認知功能進行性下降，與既往研究不完全一致。出現(xiàn)這種差異的原因可能是認知功能評定的方法和時間不同，上述研究中采用Morris 水迷宮測試，本研究使用穿梭箱實驗，并進行了強化性預訓練，檢測時間僅為4 周，且為重復測量設計，而研究顯示重復測量能改善tMCAO大鼠功能障礙。

本實驗發(fā)現(xiàn)，大鼠tMCAO 后死亡主要集中在術后1 周，死亡原因有多種，包括蛛網(wǎng)膜下腔出血、窒息、癲癇、腸脹氣等，但*重要的原因是術后大鼠運動功能差，無法正常進食，進而體質(zhì)下降，*終死亡。本研究也證實運動功能差的120min 組生存率明顯低于60min 組，因而為了降低死亡率，術后的食物選擇、進食方式及護理顯得尤為重要。

研究發(fā)現(xiàn)，SD大鼠的梗死體積對缺血再灌注時間敏感，缺血時間長梗死體積大，與本研究結(jié)果一致。研究認為，梗死體積與早期的行為學有相關關系，而與晚期的行為學表現(xiàn)不相關，可能原因是梗死大鼠對側(cè)大腦半球會產(chǎn)生適應性反應，發(fā)出運動感覺纖維跨越中線，從而出現(xiàn)運動感覺功能自發(fā)性恢復。

本研究就不同缺血再灌注時間進行研究，通過多種行為學方法對tMCAO 大鼠的運動、感覺及認知功能進行綜合評價，認為缺血60min 再灌注不出現(xiàn)認知功能障礙，且運動功能自發(fā)性恢復的速度快，因而不適用于認知功能相關的實驗研究及長期運動功能相關的行為學檢測。缺血90min、120min 再灌注組出現(xiàn)認知功能障礙，適用于認知功能相關研究，但為*大程度地排除運動功能障礙帶來干擾，認知功能相關行為學檢測*好安排在術后較長的時間范圍（28 天），運動功能恢復到一定程度。值得一提的是，缺血再灌注時間并不是MCAO模型**影響因素，動物種屬、線栓的類型及插入深度等都是tMCAO模型成功的關鍵，相關因素的問題有待進一步的研究。