摘要

ORT比較簡(jiǎn)單，可以在3天內(nèi)完成:習(xí)慣期、訓(xùn)練期和測(cè)試期。在訓(xùn)練期間，小鼠可以探索兩個(gè)相同的物體。在測(cè)試期，將一個(gè)訓(xùn)練期的物體替換為一個(gè)新物體。因?yàn)樾∈笥幸环N天生的對(duì)新奇事物的偏好，如果小鼠識(shí)別了熟悉的物體，它就會(huì)把大部分時(shí)間花在新物體上。由于這種天生的偏好，不需要積極或者消極地強(qiáng)化訓(xùn)練或長(zhǎng)時(shí)間培訓(xùn)。此外，ORT還可以被許多應(yīng)用領(lǐng)域應(yīng)用改良。比如記憶間隔可以縮短，用來(lái)檢查短期記憶，也可以延長(zhǎng)，用來(lái)檢查長(zhǎng)期記憶。藥理學(xué)干預(yù)可用在訓(xùn)練前、訓(xùn)練后或回憶前的不同時(shí)間段內(nèi)，用來(lái)調(diào)查學(xué)習(xí)的不同階段(即習(xí)得、早期或晚期鞏固或回憶)。總的來(lái)說(shuō)，ORT是一種相對(duì)壓力低且有效的小鼠記憶測(cè)試，適用于檢測(cè)藥理學(xué)、生物學(xué)或遺傳操作后的神經(jīng)心理變化。

介紹

物體識(shí)別測(cè)試(ORT)，，是一種快速有效的測(cè)試小鼠不同階段學(xué)習(xí)和記憶的方法。它zui初是在1988年由Ennaceur和Delacour提出的，主要用于大鼠; 然而當(dāng)時(shí)它也被成功地用于小鼠測(cè)試。這個(gè)測(cè)試只需要三個(gè)階段：習(xí)慣期、訓(xùn)練期和測(cè)試期。訓(xùn)練期只是對(duì)兩個(gè)相同物體的視覺(jué)探索，而測(cè)試期會(huì)用一個(gè)新物體替換之前已探索的物體之一。因?yàn)閲X動(dòng)物對(duì)新奇事物有天生的偏好，嚙齒動(dòng)物記住熟悉物體的情況下，會(huì)花更多的時(shí)間探索新物體。

ORT相對(duì)于其他嚙齒類(lèi)動(dòng)物記憶測(cè)試的主要優(yōu)勢(shì)：它依賴(lài)于嚙齒類(lèi)動(dòng)物探索新奇事物的自然傾向。因此，不需要大量的培訓(xùn)課程或任何積極或消極的強(qiáng)化來(lái)激勵(lì)促進(jìn)。與其他測(cè)試相比，ORT的壓力要小得多，而且比Morris水迷宮或Barnes迷宮等常用的記憶測(cè)試所需時(shí)間要少， 這兩種測(cè)試都需要一周甚至更長(zhǎng)時(shí)間。因此，ORT與許多其他嚙齒類(lèi)動(dòng)物記憶測(cè)試相比，ORT測(cè)試條件更接近于目前研究已認(rèn)知的條件，增加了該測(cè)試的生態(tài)學(xué)正確性。類(lèi)似地，由于ORT是一種簡(jiǎn)單的視覺(jué)回憶任務(wù)，它已被成功地用于許多物種，包括人類(lèi)和非人類(lèi)靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物，用來(lái)評(píng)估不同物種間的陳述性記憶不同面。zui后，ORT可以很容易地進(jìn)行修改，應(yīng)用在檢查學(xué)習(xí)和記憶的不同階段(如獲取、鞏固或回憶)，評(píng)估不同類(lèi)型的記憶(如空間記憶)，或評(píng)估不同的保持間隔(如短期記憶vs長(zhǎng)期記憶)。

ORT的通用性為無(wú)數(shù)的研究應(yīng)用提供了一個(gè)平臺(tái)。研究可以利用藥wu來(lái)干擾或增強(qiáng)記憶。在訓(xùn)練前、訓(xùn)練后或測(cè)試前改變給藥時(shí)間，可以暗示導(dǎo)致記憶中斷或增強(qiáng)的潛在神經(jīng)機(jī)制。類(lèi)似地，光遺傳技術(shù)可以在這些相同的或不同的時(shí)間點(diǎn)上進(jìn)行觀察神經(jīng)激活/抑制，這樣助于學(xué)習(xí)和記憶的不同階段。ORT也適用于評(píng)估轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、損傷研究、神經(jīng)退行性模型或衰老研究中的差異。訓(xùn)練和測(cè)試之間的時(shí)間被稱(chēng)為記憶保持間隔，可以通過(guò)記憶保持間隔的變化來(lái)評(píng)估短期和長(zhǎng)期記憶的變化。zui后，ORT可以作為研究學(xué)習(xí)和記憶的藥理學(xué)、遺傳學(xué)和神經(jīng)學(xué)變化的工具，或者這些工具用作研究ORT學(xué)習(xí)和記憶的基礎(chǔ)。

實(shí)驗(yàn)操作

一. 物體選擇和實(shí)驗(yàn)設(shè)置

1. 選擇不同的物體(需要很容易被小鼠識(shí)別)，但也要有相似的復(fù)雜性(紋理，形狀，顏色tu案和正確性等)，zui小化任何潛在的可能因素，否則導(dǎo)致結(jié)果偏差。

1.1 測(cè)試天生偏好和辨別能力(見(jiàn)步驟2和3)。

1.2 使用和小鼠差不多大的物體或略大的物體，減少誘導(dǎo)偏好，促進(jìn)探索(圖1)， 確保小鼠能夠爬上兩個(gè)物體或兩個(gè)都爬不上(只能爬上一個(gè)物體可能會(huì)增加探索的興趣，且爬在一個(gè)物體的時(shí)間不計(jì)入探索時(shí)間)。

1.3 每個(gè)物體至少有兩個(gè)備品。為了盡量減少測(cè)試過(guò)程中潛在的氣味線索，每個(gè)物體至少有3個(gè)備品，一個(gè)用于訓(xùn)練，一個(gè)用于測(cè)試。

1.4 使用不易碎材料制成的物品，因?yàn)樵趯?shí)驗(yàn)過(guò)程中物體損壞而丟失的物品可能會(huì)干擾試驗(yàn)的連續(xù)性，并可能對(duì)動(dòng)物造成傷害。

1.5 在使用前和使用時(shí)徹底清潔物品(以70%的乙醇為宜)

2. 為了減少明亮照明的影響，使用擴(kuò)散的低照明設(shè)備，迷宮的中心照明約20lux。使用溫度和濕度相同的房間條件，如果小鼠被從一個(gè)房間轉(zhuǎn)移到另一個(gè)房間進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每天使用前至少要讓小鼠適應(yīng)新房間1小時(shí)。

3. 在訓(xùn)練前做好對(duì)小鼠的撫摸。因?yàn)檫@個(gè)測(cè)試依賴(lài)于嚙齒類(lèi)動(dòng)物探索新奇事物的自然傾向，所以要減少任何壓力或焦慮，否則這些壓力或焦慮可能會(huì)干擾它們的探索，以及隨后探索物體的欲望。理想情況下，在試驗(yàn)前1~2周，每天撫摸小鼠1~2次，每次至少1分鐘。

4. 測(cè)試箱使用一個(gè)正方形的箱體(約40厘米× 40厘米× 40厘米，也可以進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)修改)，由白色或黑色的無(wú)孔塑料制成，與小鼠的顏色形成對(duì)比。或使用一個(gè)圓形的測(cè)試箱，因?yàn)橄噍^于方形測(cè)試箱，圓形測(cè)試箱可能更適合促進(jìn)探索行為——焦慮的小鼠可能會(huì)趴在一個(gè)方形測(cè)試箱的角落里，圓形測(cè)試箱可能更適合促進(jìn)探索行為.

4.1 在訓(xùn)練期時(shí)，將兩個(gè)相同的物體放在對(duì)角線上(即一個(gè)在西北角，一個(gè)在東南角)。如果物體太輕，小鼠能夠移動(dòng)物體，可以把物體固定在底板上，可拆卸安裝的膠體將之粘貼在底座上的效果就很好。

4.2 在測(cè)試期時(shí)，使用每個(gè)物體的第三個(gè)備品，將一個(gè)熟悉的物體和一個(gè)新物體放在與訓(xùn)練時(shí)相同的對(duì)角線上(圖2)。

4.3 平衡每組物體的分配使用，熟悉物體和新物體同時(shí)換組使用。在物體在測(cè)試箱的四個(gè)角落的位置要相同，并且一定要注意哪條對(duì)角線用于哪只動(dòng)物，以便每只小鼠在訓(xùn)練時(shí)使用的對(duì)角線與在測(cè)試時(shí)使用的對(duì)角線相同。

4.4 在使用前和使用時(shí)徹底清潔設(shè)備和物體以去除氣味(以70%的乙醇為宜)

5. 將相機(jī)安裝在測(cè)試箱上方，以獲得zui佳的探索視角。為了準(zhǔn)確分析，只使用帶有鼻尖檢測(cè)的軟件。使用軟件在開(kāi)始拍攝前，先拍攝背景圖像，并將物體放置到位。在軟件中，將探測(cè)區(qū)域設(shè)置為物體周?chē)s2~3厘米。

6. 實(shí)驗(yàn)需要記錄下這個(gè)試驗(yàn)，然后給它打分。為了減少實(shí)驗(yàn)者的干擾，要讓實(shí)驗(yàn)者在小鼠看不見(jiàn)的地方。如果在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中進(jìn)行手動(dòng)評(píng)分，請(qǐng)確保實(shí)驗(yàn)者距離測(cè)試箱1米以上，并且小鼠無(wú)法看到實(shí)驗(yàn)員。

注意:任何時(shí)候小鼠停留在物體上而不主動(dòng)進(jìn)行觸須掃瞄或嗅探都不能算作探索時(shí)間。

7. 將探索定義為當(dāng)小鼠的鼻尖指向目標(biāo)物體，并且在距離目標(biāo)2~3厘米的范圍內(nèi)，用主動(dòng)的觸須掃瞄或嗅探。不計(jì)算任何沒(méi)有積極探索性質(zhì)的爬在物體上的時(shí)間。

二. 必要的試點(diǎn)實(shí)驗(yàn)

1.1 為了小鼠能夠適應(yīng)，把小鼠從籠子里拿出來(lái)，并把它放在曠場(chǎng)(測(cè)試箱)的中間。允許小鼠自由探索5分鐘。

1.2 在訓(xùn)練期內(nèi)，在測(cè)試箱的對(duì)角線放置2個(gè)不同的物體(即西北和東南角)。把小鼠從它的籠子里拿出來(lái)，放在曠場(chǎng)(測(cè)試箱)的中央。允許自由探索10分鐘。

1.3 計(jì)算識(shí)別指數(shù)。如果沒(méi)有誘導(dǎo)偏好，則識(shí)別指數(shù)應(yīng)在零或接近零。任何顯示優(yōu)先級(jí)的物體都不要應(yīng)用于ORT。

2. 識(shí)別能力測(cè)驗(yàn)

2.1. 為了小鼠能夠適應(yīng)，把小鼠從籠子里拿出來(lái)，并把它放在曠場(chǎng)(測(cè)試箱)的中間。允許小鼠自由探索5分鐘。

2.2 在訓(xùn)練階段(T1)中，將2個(gè)相同的物體放在對(duì)角線位置。將小鼠放在測(cè)試箱中心，允許小鼠探索10分鐘。

2.3 在測(cè)試階段(T2)，將T1期間熟悉的物體備品和一個(gè)新物體放在對(duì)角線位置(即西北角和東南角)。

T1后60分鐘，將小鼠放在測(cè)試箱中心，允許自由探索10分鐘。

2.4 計(jì)算識(shí)別指數(shù)， 在保持間隔60分鐘時(shí)，鑒別指數(shù)應(yīng)高于0.25。

三. 實(shí)驗(yàn)的程序

1.1 把小鼠從它的籠子里拿出來(lái)，放在曠場(chǎng)(測(cè)試箱)的中間。允許小鼠自由探索5分鐘?；\子如果使用過(guò)一遍，就把它留作第er天用的籠子。

1.2 5分鐘后，取出小鼠并放入籠中。不要將小鼠放回原來(lái)的籠子，否則可能影響其余待測(cè)試小鼠的行為。

1.3用70%的乙醇徹底清潔小鼠的設(shè)備。

注意:在習(xí)慣化期間，可以通過(guò)計(jì)算小鼠在曠場(chǎng)中心花費(fèi)的時(shí)間來(lái)評(píng)估類(lèi)似焦慮的行為

T1的時(shí)間長(zhǎng)度時(shí)是一個(gè)有用的度量，高焦慮的小鼠可能需要10分鐘的時(shí)間來(lái)達(dá)到zui低勘探準(zhǔn)則。

2. 訓(xùn)練期(T1)

2.1 將兩個(gè)相同的物體放置在測(cè)試箱對(duì)角線的位置(即東北角和西南角)。

2.2 習(xí)慣化24小時(shí)后，將小鼠從鼠籠中取出，置于測(cè)試箱中心，與兩個(gè)相同的物體保持等距離。

2.3 允許自由探索至少5分鐘。如果使用一只低活動(dòng)量或探索量的小鼠(如大多數(shù)小鼠沒(méi)有在5分鐘內(nèi)探索兩個(gè)物體各20s， 同樣適用于試點(diǎn)實(shí)驗(yàn))， 那么就擴(kuò)展隊(duì)列中所有小鼠的試驗(yàn)到10分鐘。

2.4 試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，將小鼠移出并放入籠中?；\子如果使用過(guò)一遍，就把它留作測(cè)試時(shí)的籠舍。

2.5 用70%乙醇徹底清潔小鼠的設(shè)備和物體。

3.測(cè)試期(T2)

3.1 將T1期間使用的一個(gè)物體(熟悉的物體)和一個(gè)新物體放在測(cè)試箱對(duì)角線的位置。對(duì)每個(gè)小鼠都使用它們?cè)赥1期間相同的物體位置。

3.2 在T1到T2的選擇間隔時(shí)間內(nèi)，將小鼠從籠子中取出，并將它放在測(cè)試箱中心，保持和兩個(gè)物體的距離等距。

注:在24小時(shí)的保留間隔中，大多數(shù)小鼠將無(wú)法區(qū)分熟悉的和新的物體(通常-0.2 < d2 < 0作為可信的控制度)，如果測(cè)試益智作用，使用這個(gè)時(shí)間點(diǎn)來(lái)探測(cè)記憶增強(qiáng)。為了檢測(cè)記憶缺陷，根據(jù)小鼠的不同，使用20分鐘到4小時(shí)的較短的記憶間隔。

3.3 允許自由探索10分鐘。試驗(yàn)結(jié)束后，將小鼠移出并放入籠中。

3.4 T1和T2都在前面5分鐘評(píng)分。如果小鼠沒(méi)有達(dá)到對(duì)兩個(gè)物體的zui小20秒的探索時(shí)間，超過(guò)5分鐘繼續(xù)評(píng)分，直到總探索時(shí)間超過(guò)20秒。

四. 數(shù)據(jù)分析

1. 排除標(biāo)準(zhǔn)

1.1 在訓(xùn)練(T1)和測(cè)試(T2)期間，計(jì)算每個(gè)期間(e1和e2)中兩個(gè)的物體總探索時(shí)間。大多數(shù)小鼠兩個(gè)目標(biāo)的zui小探索時(shí)間應(yīng)該是在5分鐘內(nèi)達(dá)到20秒

1.2 對(duì)于探索程度低且不滿足zui低標(biāo)準(zhǔn)的品系，將T1和T2時(shí)間延長(zhǎng)至10 min，可以在試點(diǎn)測(cè)試期間觀察到。

1.3 評(píng)分達(dá)到5分鐘或5分鐘以上，直到達(dá)到20秒的zui低標(biāo)準(zhǔn)。

1.4. 如果小鼠在T1或T2時(shí)間10分鐘內(nèi)對(duì)兩個(gè)物體的探索都沒(méi)有達(dá)到20秒的zui低時(shí)間，則排除在分析之外，因?yàn)闊o(wú)法確定它們是否花了足夠的時(shí)間來(lái)學(xué)習(xí)/辨別。

2. 絕dui分析與相對(duì)分析

注:不同的分析公式及其相互關(guān)系見(jiàn)表1。

2.1 計(jì)算e1為2個(gè)相同物體訓(xùn)練時(shí)的總探索時(shí)間，其中a1和a2為相同物體。

E1 = a1 + a2

2.2 計(jì)算e2為測(cè)試熟悉物體(a)和新物體(b)的總探索時(shí)間。

e2 = a + b

2.3 d1簡(jiǎn)單地計(jì)算為探索新物體所花費(fèi)的時(shí)間減去探索熟悉物體所花費(fèi)的時(shí)間。絕dui鑒別測(cè)量(d1)沒(méi)有考慮小鼠或zhji療組之間探索時(shí)間的差異，盡管在某些情況下，它可能是一個(gè)更敏感的測(cè)量2。

d1 = b

2.4 d2是探索新物體所花費(fèi)的時(shí)間減去探索熟悉物體所花費(fèi)的時(shí)間除以總探索時(shí)間。zui常用的測(cè)量方法是相對(duì)判別值，通常稱(chēng)為判別指數(shù)(d2)，不受探測(cè)時(shí)間差異的影響。所有的值都在-1和+1之間。

d2 = d1 / e2

2.5 或者，計(jì)算識(shí)別或偏好指數(shù)(d3)。這是花在探索新事物上的時(shí)間除以總時(shí)間。所有的值都在0和1之間，通常乘以100，用作百分比值。

d3 = b / e2 * 100

3. 統(tǒng)計(jì)分析

1. 使用每組的平均判別值進(jìn)行單向方差分析，確定記憶性能。為了進(jìn)一步分析，事后對(duì)zhi療組與載體組以及陽(yáng)性/陰性對(duì)照組進(jìn)行雙向比較。

代表性成果

圖2顯示了ORT的一般實(shí)驗(yàn)設(shè)置。在習(xí)慣期(T0)小鼠被放置在曠場(chǎng)環(huán)境5分鐘。24小時(shí)后，小鼠被放置在兩個(gè)相同的物體的測(cè)試箱內(nèi)，允許自由探索長(zhǎng)達(dá)10分鐘(T1)。在測(cè)試期(T2)，小鼠再次被放置在測(cè)試箱，但有一個(gè)熟悉的物體和一個(gè)新的物體，并允許探索長(zhǎng)達(dá)10分鐘。T1和T2之間的停留時(shí)間間隔，可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)的zui終目標(biāo)而改變。在有代表性的數(shù)據(jù)中，因?yàn)橐种苿┯型鰪?qiáng)記憶的影響，所以經(jīng)藥wu處理的小鼠在T1后24小時(shí)內(nèi)被測(cè)試應(yīng)該沒(méi)有區(qū)別。

磷酸二酯酶2(Phosphodiesterase 2)抑制劑已被證明可以增強(qiáng)ORT中的學(xué)習(xí)和記憶。與之相比，PDE2抑制劑Bay 60-7550或ND7001在訓(xùn)練前30分鐘給予以劑量依賴(lài)性的方式顯著記憶增強(qiáng)(圖3a和3b)。在訓(xùn)練和測(cè)試的不同時(shí)間點(diǎn)給藥時(shí)，在訓(xùn)練前30分鐘、訓(xùn)練后立即和回憶前30分鐘給予給予 PDE2 抑制劑 Bay 60-7550 記憶明顯增強(qiáng)（圖 4a 和 4b）。這表明PDE2抑制增強(qiáng)了習(xí)得或早期鞏固機(jī)制以及回憶過(guò)程中的記憶。(本實(shí)驗(yàn)選用6 ~ 8周齡的實(shí)驗(yàn)未成熟雄性ICR小鼠。)

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